Înainte de experiment, toți reactivii și probele trebuie echilibrate la temperatura camerei; după topire, probele trebuie centrifugate din nou și iau supernatant pentru testare; pentru reactivi sau prepararea probei, amestecați și evitați spumarea; calibrarea și probele sunt recomandate pentru testarea dublată.

1. Adăugați pe rând soluția standard de lucru în primele două godeuri și adăugați două orificii pentru fiecare concentrație de soluție de lucru, 100 μ L din fiecare puț. Probele de testat sunt adăugate în alte godeuri, 100 μ L per godeu (pentru concentrația probei peste intervalul de testare, proba diluată cu diluții standard și probe). Microplaca a fost acoperită cu film și incubată la 37°C ℃ timp de 90 min. Sfat: Când adăugați proba pe fundul microplăcii, încercați să nu atingeți peretele găurii, agitați ușor și amestecați, pentru a evita generarea de bule. Timpul suplimentar trebuie controlat în 10 minute.

2. Anticorp/antigen biotinilat: se aruncă lichidul și se agită uscat, fără spălare. 100 μL de anticorp biotinilat/soluție de lucru au fost adăugate imediat în fiecare godeu, amestecat, microplacă plus acoperit cu film și incubat la 37℃ timp de 1 oră.

3. Spălare: agitați lichidul din orificiu, adăugați 350 μ L de lichid de spălare în fiecare godeu, înmuiați timp de 1-2 minute, aspirați sau scuturați lichidul din microplacă și uscați pe hârtie absorbantă groasă. Repetați acest pas de spălare a plăcii de 3 ori. Sfat: Mașina de spălat poate fi folosită aici și în alte etape de spălare. Fiecare pas de spălare este esențial pentru experiment.

4. Conjugat enzimatic HRP: 100 μ L de soluție de lucru conjugat enzimatic per godeu, amestecat, acoperit cu film și incubat la 37°C ℃ timp de 30 de minute.

5. Spălare: aruncați lichidul din puț și spălați placa de 5 ori în același mod ca în pasul 3.

6. Substrat: se adaugă 90 μ L de soluție de substrat (TMB) în fiecare godeu, se amestecă bine, se adaugă filmul de acoperire și se incubează la 37 ℃ timp de aproximativ 15 minute. Notă: Timpul de incubare trebuie scurtat sau extins în funcție de situația reală de dezvoltare a culorii, dar nu peste 30 de minute. Poate fi terminat atunci când apare un gradient clar în gaura standard.

7. Încetare: adăugați 50 μ L de soluție de terminare la fiecare godeu pentru a termina reacția. Notă: ordinea de adăugare a soluției de terminare ar trebui să fie aceeași cu cea a soluției de substrat.

8. Citiți: Măsurați imediat densitatea optică (OD) a fiecărui godeu la 450 nm cu un cititor de microplăci. Cititorul de microplăci trebuie deschis în prealabil pentru a configura procedura de testare.

9. După experiment, puneți reactivul neutilizat înapoi în frigider conform temperaturii de păstrare specificate până la termenul de valabilitate.